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【siRNA】siRNA转染操作步骤 siRNA原代细胞常见问题解答

文章出处:网络整理 浏览次数:发表时间:2021-12-28 15:48

原标题:【siRNA】siRNA转染操作步骤 siRNA原代细胞常见问题解答

悬浮细胞的siRNA转染操作步骤,以24孔板siRNA转染为例

【siRNA】siRNA转染操作步骤 siRNA原代细胞常见问题解答

1.siRNA转染提前1天细胞种植

悬浮细胞:采用对数生长期的细胞,数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×10*5,那么就用2×10*5的细胞进行转染。

2.siRNA转染过程

⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA,加入一定量无血清稀释液,充分混匀,制成RNA稀释液,终体积为25μl。

注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

⑵取1ul的Entranster-R4000,然后加入24ul无血清稀释液体,充分混匀,制成Entranster-R4000稀释液,终体积为25μl。室温静置5分钟。

⑶将Entranster-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)混合,室温静置15分钟。转染复合物制备完成。

⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基(可含10%血清和抗生素)的细胞上,前后移动培养皿,混合均匀。

注意:对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

⑸转染后6小时观察细胞状态,如状态良好可不必更换培养基,继续培养24-96小时得到结果。

注意:

1.siRNA转染后,继续培养24-72小时在mRNA水平得到结果,继续培养24-96小时在蛋白水平得到结果。mRNA转染后,根据需要在24小时后得到结果。

2.siRNA转染在部分实验室,由于血清和培养条件等差异,转染后镜下培养基中可能出现少量黑点状沉淀,为转染试剂和血清中蛋白结合产物,不影响转染结果和细胞状态,可通过换液除去。

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【siRNA】siRNA转染操作步骤 siRNA原代细胞常见问题解答

siRNA原代细胞常见问题解答

问:siRNA导入细胞有哪些方法,哪种最好?

答:siRNA原代细胞导入细胞有以下几种方法:化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素:细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术是最为常用的方法,而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。

问:哪种转染试剂效果好?

答:siRNA原代细胞在选择转染试剂时,一般要考虑的是特定的细胞株,而不是被导入细胞中的物质。脂质体试剂的毒性较大,建议选择非脂质体的转染试剂,如Entranster系列试剂。

问:如何筛选转染试剂?

答:好的转染试剂有以下特点:

1、对siRNA有较高的转染率;

2、对细胞的毒性小。在mRNA水平检测siRNA导入的效果比用看家基因的siRNA阳性对照检测更为准确。

问:在转染时我发现有不少细胞死亡,应该如何处理?

答:siRNA原代细胞转染后大多数细胞死亡表明:转染条件需要进一步地优化。在优化转染条件时需要考虑以下因素:转染试剂和细胞特有的自身条件。例如:siRNA与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。

问:对于难转染的细胞,应该如何提高其转染效率?转染效率又该如何确定?

答:对于难转染的细胞的转染,如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法,但是由于电转的方法对细胞损伤比较大,该方法也未必是最佳的。转染效率的确定,常用的是使用荧光标记的siRNA,通过荧光显微镜,共聚焦显微镜,流式细胞仪检测的方法。

问:转染后出现细胞死亡是什么原因?如何优化转染条件?

答:siRNA原代细胞转染后细胞死亡,原因也是多样的,如脂质体毒性,转染浓度过高,转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生,这种情况下就需要适当优化转染条件;可以选择细胞毒性小的非脂质体类的转染试剂,如英格恩的纳米材料的Entranster试剂,另外,如果siRNA所靶向的基因对于维持细胞生长是非常重要的,出现细胞死亡的现象可能正是由于基因干扰引起的,如果由于细胞死亡而影响检测的话,可以适当调整检测时间。实验条件的优化,包括转染前细胞密度调整,转染浓度,检测时间等。返回搜狐,查看更多

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